ВІДДІЛ КОМБІНАТОРНОЇ ХІМІЇ - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Розробка флуоресцентних барвників для біомедичного застосування

Пошук і розробка нових високоефективних флуоресцентних зондів для біології та медицини є одним з найголовніших напрямків діяльності нашої групи. Нами запропоновано та застосовано для виконання комерційних дослідницьких проектів оригінальний підхід щодо створення флуоресцентних зондів із заданими властивостями, так званий метод "провідного барвника" (lead dye). Велика історична колекція, що налічує понад 2000 барвників різних класів (поліметинціанінів, стирилів, кумаринів і металокомплексів), є основою для виконання таких досліджень. Ряд чутливих флуоресцентних барвників для неспецифічної детекції білків у гелях (барвники серії LUCY) було розроблено нашою групою для Sigma-Aldrich Inc. Головною перевагою зондів Lucy 506, Lucy 569 та Lucy 565 є їх висока чутливість, проста та швидка процедура забарвлення та слабка залежність чутливості від типу білка. Ці барвники демонструють широкий лінійний діапазон концентрацій та дозволяють детектувати близько 5-10 нг білка на смугу (рис. 1).

Рис. 1. Межі детекції білка в ДСН-поліакриламідному гелі за допомогою зондів LUCY-506 та LUCY-565, розроблених нами для Sigma-Aldrich Inc., у порівнянні із зондом SYPRO Ruby (Invitrogen Corp.).

Спільно з BioRad Inc. ми розробили нові скварилієві барвники, які можна використовувати для неспецифічної флуоресцентної детекції білків у системах розділення.
Нещодавно у співробітництві з Sigma-Aldrich ми успішно завершили дослідницький проект, що мав на меті розробку нового високочутливого флуоресцентного зонда для візуалізації ДНК у гелях.

1. V. Kovalska, D. Kryvorotenko, M. Losytskyy, P. Nording, A. Rueck, B. Schoenenberger, S. Yarmoluk, F. Wahl. Detection of polyamino acids using trimethincyanine dyes // US Patent US2006207881.
2. K.D. Volkova, V.B. Kovalska and S.M. Yarmoluk. Modern techniques for protein detection on polyacylamide gels: With a brief discussion of the problems arising from the scientific use of dyes of undisclosed structures // Biotech. Histochem. – 2007. – Vol. 82, Iss. 4&5. – P. 201-208.
3. T.R. Berkelman, S.M. Yarmoluk, V.B. Kovalska, M.Yu. Losytskyy, K.D. Volkova. Use of squaraine dyes to visualize protein during separations // Patent Application WO 2008/027821 A1, 06.03.2008.

Розробка флуоресцентних зондів для детекції бета-складчастих білкових структур

Розробка барвників для флуоресцентної детекції бета-складчастих білкових структур, які вважають ознаками ряду нейродегенеративних розладів, є новим напрямком наших досліджень. На сьогоднішній день існує обмежена кількість барвників, що селективно взаємодіють з агрегованою формою протеїнів, крім того, більшість із цих барвників не є універсальними для використання у різних експериментальних системах.
Нещодавно моно- (T-284) і триметинові (SH-516) ціаніни (рис. 2) були вперше запропоновані як високоефективні барвники для детекції амілоїдних утворень, зокрема агрегатів альфа синуклеїну, які є маркерами хвороби Паркінсона. Ці барвники дозволяють кількісно визначати концентрації від 1 нмоль/мл агрегованих протеїнів, що відповідає рівню чутливості комерційно доступних барвників, які пропонуються для цього використання.

Рис. 2. Моно- та триметинові барвники, чутливі до амілоїдних утворень.

Хороший рівень чутливості та висока відтворюваність результатів, що притаманні цим барвникам, роблять можливою розробку на їх основі флуорометричних методів моніторингу процесів фібрилоутворення. Такі методи в подальшому можуть бути адаптовані для скринінгових систем для пошуку потенціальних інгібіторів процесу фібрилогенезу.

1. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, A.O. Balanda, R.J. Vermeij, V. Subramaniam, Yu.L. Slominskii and S.M. Yarmoluk. Cyanine dye-protein interactions: looking for fluorescent probes for amyloid structures // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. – 2007. – Vol. 70, No. 5. – P. 727-733.
2. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, A.O. Balanda, M.Yu. Losytskyy, A.G. Golub, R.J. Vermeij, V. Subramaniam, O.I. Tolmachev and S.M. Yarmoluk. Specific fluorescent detection of fibrillar α-synuclein using mono- and trimethine cyanine dyes // Bioorganic and Medicinal Chemistry. – 2008. – Vol. 16, No. 3. – P. 1452-1459.

Розробка флуоресцентних зондів для детекції та зображення біологічних об’єктів за допомогою двофотонного збудження

Двофотонне збудження (ДФЗ) флуоресцентних зондів є сучасним підходом в біологічних та медичних дослідженнях, який дедалі ширше використовується для детектування біологічних молекул і флуоресцентного зображення біологічних об’єктів. Використання ДФЗ флуоресцентних зондів у процедурах детектування біологічних об’єктів дає змогу збуджувальному променю глибше проникати в тканину, збуджувати видиму флуоресценцію в ближньому інфрачервоному спектральному діапазоні, де біологічні об’єкти є прозорими, зменшувати фоторуйнування досліджуваних об’єктів та отримувати тривимірне зображення біологічного об’єкта.
Нещодавно ряд гомодимерних (рис. 3a) та мономерних бензотіазолових стирилових барвників, що містять спермінову лінкерну чи кінцеву групу, були запропоновані як ефективні ДФЗ зонди для детекції ДНК. Ці барвники підвищують інтенсивність флуоресценції в присутності ДНК на 3 порядки, а їх значення перерізу двофотонного поглинання становить 4,7-7,4х10^-50 см⁴с.
Крім того, було розроблено нові стирилові барвники на основі тетрагідропіроло[1,2-a]-тієно[2,3-d]піридинієвого гетероциклу (рис. 3, b). Барвники цього класу демонструють яскраве випромінювання в присутності РНК, тоді як інтенсивність їх випромінювання в присутності ДНК є значно (до 8 разів) нижчою. Для цих барвників у присутності РНК було отримано спектри флуоресценції при двофотонному збудженні випромінюванням YAG:Nd³⁺ лазера з довжиною хвилі 1064 нм (тривалість імпульсу 20 нс). Таким чином, ми вважаємо, що оксо-тієно[2,3-d]піридинієві стирилціаніни є перспективними зондами для детекції РНК із використанням ДФЗ.

Рис. 3. Гомодимерні стирилціанінові барвники, які є перспективними для ДФЗ флуоресцентної детекції ДНК.

Нещодавно було показано, що гомодимерний стириловий барвник здатний проникати у клітину і може успішно використовуватися для ДФЗ флуоресцентного зображення живих клітин (рис. 4).

Рис. 4. ДФЗ флуоресцентне зображення HeLa клітин, забарвлених барвником DBos-21. Флуоресцентне випромінювання збуджували фемтасекундним імпульсним титан-сапфіровим лазером, довжина хвилі збудження 880 нм.

Для бензотіазолових стирилціанінових барвників ми вивчали механізм їх взаємодії з длДНК. Ґрунтуючись на здобутих результатах, інтеркаляційних механізм зв’язування було запропоновано для мономерного барвника, що містить спермінову N-алкільну кінцеву групу, а також для гомодимерного барвника з позитивно зарядженою N-алкільною лінкерною групою.

1. V.P. Tokar, M.Yu. Losytskyy, V.B. Kovalska, D.V. Kryvorotenko, A.O. Balanda, V.M. Prokopets, M.P. Galak, I.M. Dmytruk, V.M. Yashchuk and S.M. Yarmoluk. Fluorescence of styryl dyes-DNA complexes induced by single- and two-photon excitation // Journal of Fluorescence. – 2006. – Vol. 16, No. 6. – P. 783-791.
2. V.B. Kovalska, D.V. Kryvorotenko, A.O. Balanda, M.Yu. Losytskyy, V.P. Tokar, S.M. Yarmoluk. Fluorescent homodimer styrylcyanines: synthesis and spectral-luminiscent stidies in nucleic acids and protein complex // Dyes and Pigments. – 2005. – Vol. 67, No. 1. – P. 47-54.

3. V.M. Yashchuk, V.Yu. Kudrya, M.Yu. Losytskyy, V.P. Tokar, S.M. Yarmoluk, I.M. Dmytruk, V.M. Prokopets, V.B. Kovalska, A.O. Balanda, D.V. Kryvorotenko, T.Yu. Ogul'chansky. The optical biomedical sensors for DNA detection and imaging based on two-photon excited luminescent styryl dyes: phototoxic influence on the DNA // Proceedings of SPIE. – 2007. – Vol. 6796. – 67960M. – 14 pp.
4. N. Akbay, M.Yu. Losytskyy, V.B. Kovalska, A.O. Balanda and S.M. Yarmoluk. The mechanism of benzothiazole styrylcyanine dyes binding with dsDNA: studies by spectral-luminescent methods // Journal of Fluorescence. – 2008. – V.18, No.1. – P. 139-147.

Довгохвильові барвники для флуоресцентної детекції білків

Флуоресцентна детекція білків із застосуванням довгохвильового збудження широко використовується в біомедичних дослідженнях, оскільки має такі переваги інфрачервоних методів, як можливість використання недорогих діодних лазерів як джерел збудження, а також зменшення автофлуоресценції біологічних молекул на довжинах хвилі більших за 600 нм. Завдяки їх фізико-хімічним властивостям, таким як поглинання світла у видимій та ближній інфрачервоних ділянках спектра, та інтенсивній флуоресценції сквараїнові барвники є придатними для зазначеного вище застосування.
Для широкого ряду сквараїнових барвників на основі індоленінового, бензоксазолового, бензотіазолового та бензоселеназолового гетероциклів було проведено тестування їх чутливості до різних білків.
Було показано, що несиметричні індоленінові сквараїнові барвники значно підвищують інтенсивність випромінювання в присутності БСА. 3-оксо-заміщений індоленіновий барвник (рис. 5) також демонструє значне зростання флуоресцентного сигналу в присутності ЛСА та овальбуміну.
Для симетричних бензотіазолових та бензоселеназолових барвників із N-гексиловою кінцевою групою (рис. 5) було продемонстровано підвищення інтенсивності флуоресценції в тисячі разів у присутності БСА-ДСН міцел. Більшість досліджених бензтіазолових і бензоксазолових сквараїнів демонструють інтенсивну флуоресценцію в присутності як БСА, так і ЛСА (людський сироватковий альбумін). Водночас бензотіазолові та бензоселеназолові барвники, що містять N-етилові кінцеві групи, виявили значну чутливість до ЛСА та можуть бути запропоновані для специфічної детекції ЛСА. Використання деяких із бензтіазолових барвників дає змогу кількісно визначати ЛСА в діапазоні концентрацій від 0,2 до 500 мг/мл, що відповідає рівню чутливості комерційно доступних барвників, таких як CBB і Pyrogallol Red Protein.

Рис. 5. Структури досліджених сквараїнових барвників.

Зараз ми продовжуємо наші дослідження щодо можливості застосування різних сквараїнових барвників для специфічної та неспецифічної детекції білків.

1. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, A.L. Tatarets, L.D. Patsenker, D.V. Kryvorotenko, S.M. Yarmoluk. Spectroscopic study of squaraines as protein-sensitive fluorescent dyes // Dyes and Pigments. – 2007. – Vol. 72, Nо 3 – P. 285-292.

2. Volkova K.D., Kovalska V.B., Losytskyy M.Y., Bento A., Reis L.V., Santos P.F., Almeida P., Yarmoluk S.M. Studies of benzothiazole and benzoselenazole squaraines as fluorescent probes for albumins detection // J. Fluorescence. – in press.

Ціанінові барвники, що зв’язуються з малою борозенкою ДНК, для детекції дсДНК

Розробка барвників, що взаємодіють із дволанцюговими (дл) ділянками ДНК, є актуальною для ряду сучасних діагностичних і дослідницьких методик, таких як синтез кДНК для створення бібліотек, очистка ДНК-фрагментів для субклонування, моніторингу перебігу реакції ампліфікації та визначення наявності ДНК під час виготовлення лікарських препаратів.
Розробка барвників, що взаємодіють із ДНК за борозенковим механізмом, є одним зі шляхів отримання зондів, високо специфічних до длДНК. Відомо, що для ціанінів борозенковий механізм взаємодії переважає у випадку барвників із більш ніж однією метиновою групою в поліметиновому ланцюжку. Нещодавно нами було показано, що триметинові ціаніни, молекули яких мають серповидну форму, є ефективними флуоресцентними зондіми (рис. 6a), що взаємодіють із длДНК за борозенковим механізмом, та демонструють високу селективність до длДНК порівняно з РНК. Окрім того, продемонстровано можливість створення високо специфічних до длДНК зондів шляхом модифікації циклопентанової чи циклогексанової групи в поліметиновому ланцюжку пентаметинового ціанінового барвника (рис. 6b).

Рис. 6. Триметинові (a) та пентаметинові (b) ціанінові барвники, які згідно з результатами наших досліджень зв’язуються з борозенкою ДНК.

Слід зазначити, що для селективної детекції дсДНК можуть бути використані флуоресцентні агрегати, специфічно утворені в борозенці двоспіральної (дс) ДНК. Ми встановили, що триметинціаніновий барвник Cyan βiPr (рис. 7) утворює флуоресцентні агрегати на дсДНК, чого не спостерігається ані у випадку вільного барвника у водному буфері, ані в присутності РНК чи білка. Висока селективність утворення флуоресцентних J-агрегатів Cyan βiPr на AT-містких полінуклеотидах порівняно з GC-місткими вказує на утворення агрегатів у борозенці дсДНК (рис. 7). Ці флуоресцентні агрегати можна успішно використовувати для детектування окремих AT-містких молекул ДНК за допомогою флуоресцентної мікроскопії (рис. 8).

Рис. 7. Хімічна структура триметинового ціанінового барвника Cyan βiPr, що утворює флуоресцентні J-агрегати на AT-послідовностях дсДНК.

Рис. 8. Модель J-агрегату Cyan βiPr, утвореного в малій борозенці poly(dA)-poly(dT). Модель побудовано за допомогою пакета програм HyperChem 5.0 на основі даних спектрально-люмінесцентних досліджень.

Рис. 9. Зображення J-агрегатів Cyan βiPr, утворених на молекулах полінуклеотиду poly(dA)-poly(dT), отримане за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

1. V.B. Kovalska, K.D. Volkova, M.Yu. Losytskyy, O.I. Tolmachev, A.O. Balanda and S.M. Yarmoluk. 6’-Disubstituted benzothiazole trimethine cyanines – new fluorescent dyes for DNA detection // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2006. – Vol. 65, Nо 2. – P. 271-277.
2. M.Yu. Losytskyy, K.D. Volkova, V.B. Kovalska, I.E. Makovenko, Yu.L. Slominskii, O.I. Tolmachev, S.M. Yarmoluk. Fluorescent properties of pentamethine cyanine dyes with cyclopentene and cyclohexene group in presence of biological molecules // Journal of Fluorescence. – 2005. – Vol. 15, Nо 6. – P. 849-857.
3. V.B. Kovalska, M.Yu. Losytskyy and S.M. Yarmoluk. Luminescence spectroscopic studies of trimethinecyanines substituted in polymethine chain with nucleic acids and proteins // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2004. – Vol. 60, Nо 1-2. – P. 129-136.
4. M.Yu. Losytskyy, V.M. Yashchuk, S.S. Lukashov and S.M. Yarmoluk. Davydov Splitting in Spectra of Cyanine Dye J-Aggregates, Formed on the Polynucleotides // Journal of Fluorescence. – 2002. – Vol. 12, Nо 1. – P. 109-112.