Флуоресцентні барвники для вивчення бета-складчастих білкових утворень
Розробка барвників для флуоресцентної детекції бета-складчастих білкових структур, які вважають ознаками ряду нейродегенеративних розладів, є одним з найбільш важливих напрямів наших досліджень. Нещодавно ми запропонували ціанінові барвники як новий клас амілоїд-специфічних флуоресцентних зондів [1, 2]. Так, моно- (T-284) та триметинові (SH-516) ціаніни (рис. 1) дають змогу кількісно визначати концентрації від 1 нмоль/мл фібрилярного альфа-синуклеїну (АСН), що відповідає рівню чутливості комерційно доступних барвників [3].
Ці барвники продемонстрували здатність поетапно відображати перетворення мономерного білка АСН у фібрили, показуючи хорошу відтворюваність результатів, значно кращу, ніж у випадку загальновживаного барвника Тіофлавін Т [3]. Дані флуоресцентної спектроскопії, спектроскопії поляризації флуоресценції та спектроскопії з часовим розділенням, а також атомно-силова мікроскопія, виконані у співробітництві з проф. В. Субраманіамом (Університет Твенте, Голландія), дозволили пролити світло на механізм утворення комплексу ціанінового барвника з амілоїдною фібрилою.
Рис. 1. Ціанінові барвники, чутливі до амілоїдних структур (T-284, SH-516 та 7519).
На основі цих ціанінових барвників було запропоновано флуоресцентну методику скринінгу потенційних інгібіторів утворення амілоїдних фібрил. Відтак бензотіазоловий триметиновий ціаніновий барвник 7519 (рис. 1) було успішно застосовано для вивчення серії флавоноїдів як інгібіторів агрегації інсуліну in vitro [4]. Крім того, з використанням згаданої методики ми вперше продемонстрували високу активність фталоціанінів з позаплощинними лігандами як інгібіторів фібрилогенезу (рис. 2).
Рис. 2. Фталоціанін цирконію, що містить позаплощинні замісники – лізинові фрагменти.
1. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, A.O. Balanda, R.J. Vermeij, V. Subramaniam, Yu.L. Slominskii and S.M. Yarmoluk. Cyanine dye-protein interactions: looking for fluorescent probes for amyloid structures // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. – 2007. – Vol. 70, Iss. 5. – P. 727-733.
2. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, A.O. Balanda, M.Yu Losytskyy, A.G. Golub, R.J. Vermeij, V. Subramaniam, O.I. Tolmachev and S.M. Yarmoluk. Specific fluorescent detection of fibrillar α-synuclein using mono- and trimethine cyanine dyes // Bioorganic and Medicinal Chemistry. – 2008. – Vol. 16, Iss. 3. – P. 1452-1459.
3. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, G.M. Segers-Nolten, G. Veldhuis, V. Subramaniam, S.M. Yarmoluk. Explorations of the application of cyanine dyes for quantitative α-synuclein detection // Biotechnic & Histochemistry. – 2009. – 84. – P. 55-61.
4. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, M.Yu. Losytskyy, G. Veldhuis, G. M. J. Segers-Nolten, O.I. Tolmachev, V. Subramaniam, S.M. Yarmoluk. Studies of interaction between cyanine dye T-284 and fibrillar alpha-synuclein // Journal of Fluorescence. – 2010. – Vol. 20, N 6. – P. 1267-1274.
5. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, D. Inshin, Y.L. Slominskii, O.I. Tolmachev, S.M. Yarmoluk . Novel fluorescent trimethine cyanine dye 7519 for amyloid fibril inhibition assay // Biotechnic & Histochemistry. – Early Online, 1-4.
У живих організмах геномна ДНК в основному знаходиться у формі дволанцюгової спіралі (длДНК), проте видається можливою також присутність деяких інших конформацій. Відомо, що нуклеотидні послідовності з високим вмістом гуаніну згортаються в чотирьохланцюгові (G-квадруплекси, G4-ДНК) або триланцюгові (триплекси) структури, в яких нуклеотидні основи з'єднані за принципом хугстенівських пар (рис. 3). Разом з тим, проблема гіпотетичної ролі триплексних і квадруплексних ділянок ДНК у стабільності генної регуляції та стабільності генома досі не вирішена. Тому розробка специфічних зондів для детекції чотири- та триланцюгових конформацій на фоні канонічної дволанцюгової може мати велике наукове та практичне значення.
Рис. 3. Структури G-G-C тріади в poly(dG-dG)-poly(dC) (A) і G-тетради в G4-ДНК (B).
З допомогою спектрально-люмінесцентних методів нами вивчено взаємодію з длДНК і неканонічними триплексами й G-квадруплексами монометинового (Cyan 40) та триметинового (Cyan 2) ціанінових барвників (рис. 4), чутливість яких до ДНК була продемонстрована нами раніше. Cyan 40 проявив значну селективність до триплексів порівняно з квадруплексами та длДНК, тоді як Cyan 2 виявився значно менш селективним щодо неканонічних структур ДНК, зв'язуючись з високою афінністю як з триплексною, так і з квадруплексною структурою. Нами було висловлене припущення, що Cyan 40 та Cyan 2 взаємодіють з триплексом ДНК за механізмом зв'язування з борозенкою, тоді як утворення комплексу з G4-ДНК відбувається за рахунок інтеркаляції.
Рис. 4. Хімічні структури барвників Cyan 40 та Cyan 2.
Ми вважаємо, що вивчені ціанінові барвники можуть бути використані для створення на їхній основі високочутливого методу детекції та визначення кількості неканонічних структур ДНК у геномі, а також для пошуку й розробки агентів, які б специфічно зв'язувались з такими ділянками ДНК та інгібували їх функціонування.
V.B. Kovalska, M.Yu. Losytskyy, S.M. Yarmoluk, I. Lubitz, A.B. Kotlyar. Mono and trimethine cyanines Cyan 40 and Cyan 2 as probes for highly selective fluorescent detection of non-canonical DNA structures // Journal of Fluorescence. – Early Online. – DOI 10.1007/s10895-010-0709-y.
Пошук та розробка нових високоефективних флуоресцентних зондів для біології та медицини є одним із найголовніших напрямів діяльності нашої групи. Нами запропоновано та застосовано для виконання комерційних дослідницьких проектів оригінальний підхід щодо створення флуоресцентних зондів із заданими властивостями, так званий метод «провідного барвника» (lead dye). Велика історична колекція, що налічує понад 2000 барвників різних класів (поліметинціанінів, стирилів, кумаринів та металокомплексів), є основою для виконання таких досліджень.
У співробітництві з BioRad Inc. ми розробили нові скварилієві барвники, які можна використовувати для неспецифічної флуоресцентної детекції білків у системах розділення.
Ряд чутливих флуоресцентних барвників для неспецифічної детекції білків у гелях (барвники серії LUCY) було розроблено нашою групою для Sigma-Aldrich Inc. Головною перевагою зондів Lucy 506, Lucy 569 та Lucy 565 є їхня висока чутливість, проста та швидка процедура забарвлення та слабка залежність чутливості від типу білка. Ці барвники демонструють широкий лінійний діапазон концентрацій і дають змогу детектувати близько 5-10 нг білка на смугу (рис. 5).
Рис. 5. Межі детекції білка в ДСН-поліакриламідному гелі за допомогою зондів LUCY-506 та LUCY-565, розроблених нами для Sigma-Aldrich Inc., у порівнянні із зондом SYPRO Ruby (Invitrogen Corp.).
Нещодавно спільно з Sigma-Aldrich ми успішно завершили дослідницький проект, що мав на меті розробку нового високочутливого флуоресцентного зонда для візуалізації ДНК у гелях. Розроблений протягом виконання цього проекту флуоресцентний барвник Nancy-520 дозволяє візуалізувати до 0,5 нг дсДНК на смугу в агарозному гелі. Крім того, Nancy-520 можна застосовувати для визначення концентрації дсДНК у розчині з лінійним діапазоном від 0 до 2 мкг/мл ДНК.
1. A . Rueck, B. Schoenenberger, S. Yarmoluk, V. Kovalska, M. Losytskyy, Y. Slominskii. Nucleic acid fluorescent stains // US Patent Application Publication US2010041045, 18.02.2010.
2. T.R. Berkelman, S.M. Yarmoluk, V.B. Kovalska, M.Yu. Losytskyy, K.D. Volkova. Use of squaraine dyes to visualize protein during separations // Patent Application Publication WO 2008/027821 A1, 06.03.2008.
3. K.D. Volkova, V.B. Kovalska and S.M. Yarmoluk. Modern techniques for protein detection on polyacrylamide gels: problems arising from the use of dyes of undisclosed structures for scientific purposes // Biotech. Histochem. – 2007. – Vol. 82, Iss. 4&5. – P. 201-208.
4. V. Kovalska, D. Kryvorotenko, M. Losytskyy, P. Nording, A. Rueck, B. Schoenenberger, S. Yarmoluk, F. Wahl. Detection of polyamino acids using trimethincyanine dyes // US Patent Application Publication US2006207881, 21.09.2006.
Альбуміни є важливими білками плазми, які циркулюють в крові. Оскільки сироватковий альбумін є надійним індикатором прогнозування захворюваності та смертності, хвороби печінки та інших хвороб, та діє як носій поживних речовин та ліків, вкрай необхідними є аналітичні методи вивчення альбумінів. Перевагами флуорометричних методів над іншими є їх висока чутливість, селективність та зручність. Сквараїнові барвники описані в літературі як ефективні нековалентні флуоресцентні мітки для альбумінів, які демонструють високий квантовий вихід при зв'язуванні з цими білками.
Для широкого ряду сквараїнових барвників на основі індоленінового, бензоксазолового, бензотіазолового та бензоселеназолового гетероциклів було проведено тестування їх чутливості до різних альбумінів. Досліджених симетричні бензтіазолові та бензоксазолові сквараїни демонструють інтенсивну флуоресценцію в присутності як БСА так і ЛСА (людський сироватковий альбумін). Водночас барвники, що містять N-етилові кінцеві групи, виявили значну чутливість до ЛСА та можуть бути запропоновані для специфічної детекції ЛСА. Використання деяких з бензтіазолових барвників дозволяє кількісно визначати ЛСА в діапазоні концентрацій від 0,2 мг/мл до 500 мг/мл, що відповідає рівню чутливості комерційно доступних барвників, таких як CBB та Pyrogallol Red Protein.
Показано, що несиметричні індоленінові сквараїнові барвники значно підвищують інтенсивність випромінювання в присутності БСА. 3-оксо-заміщений індоленіновий барвник (рис. 6) також демонструє значне зростання флуоресцентного сигналу в присутності ЛСА та овальбуміну.
Рис. 6. Структури досліджених сквараїнових барвників.
Для барвників, які демонструють значний флуоресцентний відгук на присутність ЛСА, проводяться дослідження механізму зв'язування барвника з ЛСА та специфічності барвників до певних сайтів зв'язування. Ми вважаємо, що ці дослідження дадуть змогу розробити на основі сквараїнів флуорометричну методику вивчення фармакокінетики та фармакодинаміки потенційних лікарських засобів та характеризації їх зв'язування з ЛСА.
1. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, M.Yu. Losytskyy, L.V. Reis, P.F. Santos, P. Almeida, D.E. Lynch, S.M. Yarmoluk. Aza-substituted squaraines for the fluorescent detection of albumins // Dyes and Pigments, in press.
2. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, M.Y. Losytskyy, A. Bento, L.V. Reis, P.F. Santos, P. Almeida, S.M. Yarmoluk. Studies of benzothiazole and benzoselenazole squaraines as fluorescent probes for albumins detection // J. Fluorescence. – 2008. – Vol. 18, № 5. – P. 877-882.
3. K.D. Volkova, V.B. Kovalska, A.L. Tatarets, L.D. Patsenker, D.V. Kryvorotenko, S.M. Yarmoluk. Spectroscopic study of squaraines as protein-sensitive fluorescent dyes // Dyes and Pigments. – 2007. – Vol. 72, No. 3 – P. 285-292.
© ВІДДІЛ КОМБІНАТОРНОЇ ХІМІЇ